Il Fe(II) di tutte le forme di emoglobina, ad eccezione della sulfoemoglobina, viene ossidato dal ferrocianuro a Fe(III) a metaemoglobina, che a sua volta reagisce con il cianuro ionizzato (CN-) per formare la cianmetemoglobina, un derivato molto stabile che assorbe a 540 nm. L'intensità del colore formato è proporzionale alla concentrazione di emoglobina totale nel campione.
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