Il Fe (II) di tutte le forme di emoglobina, ad eccezione della sulfoemoglobina, viene ossidato al Fe(III) della metaemoglobina che, a sua volta, reagisce con il cianuro ionizzato (CN-) per formare la cianmetemoglobina, un derivato stabile che assorbe a 540 nm. L'intensità del colore prodotto è proporzionale alla concentrazione di emoglobina totale nel campione.
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