La bilirubina viene convertita in azobilirubina colorata dall'acido solfanilico diazotizzato e viene misurata fotometricamente. Delle due frazioni di bilirubina presenti nel siero - la bilirubina-glucuronide e la bilirubina libera legata all'albumina - solo la prima reagisce direttamente, mentre l'albumina libera reagisce dopo essere stata spostata dalle proteine da un acceleratore. La differenza tra due misure di bilirubina totale (con acceleratore) e bilirubina diretta (senza acceleratore) consente di calcolare la bilirubina indiretta.
I termini "bilirubina diretta" e "indiretta" si riferiscono esclusivamente alle caratteristiche della reazione in presenza o in assenza di un acceleratore o di un solubilizzante e sono solo equivalenti approssimativi delle due frazioni di bilirubina.
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