Il metodo si basa sull'idrolisi dell'a-naftilfosfato a pH 5,0 da parte della fosfatasi acida (FAC), producendo a-naftolo e fosfato inorganico. Il pentandiolo agisce come accettore di fosfato, aumentando la sensibilità della reazione. L'a-naftolo reagisce con un sale di diazonio, il Fast Red TR*, formando un complesso colorato direttamente proporzionale all'attività della FAC nel campione.
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