La bilirubina diretta (coniugata) reagisce con il sale di diazonio 2,4-diclorofenildiazonio (2,4-DPD) in presenza di acido solfammico per formare azo-bilirubina; questo complesso colorato può essere misurato fotometricamente a 546 nm. Delle due frazioni di bilirubina presenti nel siero - la bilirubina-glucuronide (coniugata) e la bilirubina libera legata all'albumina (non coniugata) - solo la prima reagisce direttamente, mentre la bilirubina libera reagisce dopo essere stata spostata dalle proteine (albumina) da un acceleratore. La differenza tra le due misurazioni: bilirubina totale (con acceleratore) e bilirubina diretta (senza acceleratore) consente di calcolare la bilirubina indiretta. I termini "bilirubina diretta" e "indiretta" si riferiscono esclusivamente alle caratteristiche della reazione in presenza o in assenza di un acceleratore o di un solubilizzante e sono solo equivalenti approssimativi delle due frazioni di bilirubina.
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