Kit di test da ricerca LS-K268

di proteina totale (TP)di ATPdi adenosina monofosfo

La 5-AMP-activated protein kinase (AMPK) è un sensore chiave dell'equilibrio energetico intracellulare. L'AMPK viene attivata in risposta a un aumento del rapporto AMP/ATP, che può essere causato da una serie di fattori come la contrazione muscolare, la fame o l'ipossia. L'AMPK è un complesso proteico eterotrimerico composto da subunità alfa (63 kDa), beta (38 kDa) e gamma (38 kDa). Per ogni subunità sono state identificate delle isoforme (alfa-1, alfa-2, beta-1, beta-2, gamma-1, gamma-2, gamma-3) che teoricamente permettono la formazione di 12 proteine diverse. La subunità alfa contiene un dominio serina/treonina chinasi e le subunità regolatrici contengono siti di legame per AMP e ATP e per il glicogeno. L'AMPK è attivata dalla fosforilazione su Thr-172 all'interno del dominio catalitico. Il legame con l'AMP determina un aumento dell'attività dell'AMPK da 2 a 5 volte rispetto al livello basale. Il legame dell'AMP alla subunità alfa provoca l'attivazione allosterica della chinasi e induce un cambiamento conformazionale nel dominio della chinasi che protegge l'AMPK dalla de-fosforilazione della Thr-172. Questo ELISA su base cellulare misura l'AMPK fosforilata in cellule intere e normalizza il segnale rispetto al contenuto proteico totale. L'anticorpo riconosce entrambe le subunità alfa e, pertanto, può essere utilizzato per cellule provenienti da tutti i tessuti (uomo, topo, ratto). Questo saggio semplice ed efficace elimina la necessità di preparare il lisato cellulare e può essere utilizzato per studiare la regolazione dell'AMPK in saggi a breve e lungo termine. In questo saggio, le cellule coltivate in piastre da 96 pozzetti vengono fissate e permeabilizzate nei pozzetti. La fosforilazione di AMPK (pAMPK) viene misurata con un ELISA fluorescente seguito dalla misurazione della proteina totale in ogni pozzetto.