Kit di test da ricerca CFTK-HMM-0076

per ricerca medicadi coagulazioneTMB

Nome del prodotto
Kit ELISA per fattore di coagulazione VIIa umano attivato (FVIIa) (Cod. prod.: CFTK-HMM-0076)

Applicazione
Determinazione quantitativa in vitro del fattore di coagulazione VIIa umano attivato (FVIIa) in siero, plasma, omogeneizzati tissutali, sovranatanti di colture cellulari e fluidi biologici correlati.

Principio di rilevamento
Il kit è basato su un ELISA sandwich in un unico passaggio con doppio anticorpo. Campioni, standard e anticorpo di rilevamento coniugato HRP vengono aggiunti ai pozzetti pre‑coated con anticorpo di cattura contro FVIIa, incubati e lavati. Lo sviluppo del colore utilizza il substrato TMB catalizzato dall'HRP (blu) e viene arrestato con acido (giallo). L'intensità del colore è proporzionale alla concentrazione di FVIIa e si misura a 450 nm per il calcolo della concentrazione del campione.

Preparazione dei campioni

• Siero: Prelevare sangue in provette separatrici, lasciare coagulare 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C, centrifugare a 1000×g per 20 min e raccogliere il surnatante; conservare a -20°C o -80°C se necessario. Evitare cicli ripetuti di congelamento/scongelamento.
• Plasma: Prelevare con EDTA o eparina, centrifugare a 1000×g per 15 min a 2–8°C entro 30 min dal prelievo, raccogliere il surnatante; conservare a -20°C o -80°C. Evitare cicli ripetuti di congelamento/scongelamento.
• Omogeneizzato tissutale: Risciacquare il tessuto con PBS freddo (0,01 M, pH 7,4), pesare e tritare, aggiungere PBS (tipicamente 1:9 p/p), opzionalmente aggiungere inibitori delle proteasi, omogeneizzare sul ghiaccio, sonicare o eseguire cicli congelamento/scongelamento se necessario, centrifugare a 5000×g per 5–10 min e raccogliere il surnatante.
• Sovranatante di coltura cellulare/altro: Centrifugare a 1000×g per 20 min e utilizzare il surnatante per l'analisi o conservare a -20°C/-80°C. Evitare campioni emolizzati.

Reagenti / strumenti / consumabili necessari

• Lettore di micropiastre (450 nm)
• Pipette di precisione e puntali: 0,5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL
• Incubatore a 37°C o termostato
• Acqua distillata o deionizzata

Concentrazioni standard

• 16 ng/mL
• 8 ng/mL
• 4 ng/mL
• 2 ng/mL
• 1 ng/mL
• 0,5 ng/mL

Preparazione dei reagenti
Portare i reagenti del kit a temperatura ambiente prima dell'uso. Preparare il tampone di lavaggio 20× diluendolo 1:20 con acqua distillata (1 parte di tampone 20× + 19 parti di acqua).

Procedura (sintesi)

• 1. Equilibrare la piastra a temperatura ambiente per 20 min; usare i pozzetti necessari e sigillare i restanti per lo stoccaggio a 4°C.
• 2. Aggiungere 50 µL di standard nei pozzetti standard.
• 3. Aggiungere 50 µL di campione nei pozzetti campione (non aggiungere nei pozzetti vuoti).
• 4. Aggiungere 100 µL di anticorpo di rilevamento coniugato HRP in ogni pozzetto standard e campione (escluso il vuoto), sigillare e incubare 60 min a 37°C.
• 5. Eliminare il liquido e lavare ogni pozzetto con 350 µL di soluzione di lavaggio, lasciare 1 min; ripetere il lavaggio 5 volte (o usare lavatrice per piastre).
• 6. Aggiungere 50 µL del substrato A e 50 µL del substrato B in ogni pozzetto, incubare 15 min a 37°C.
• 7. Aggiungere 50 µL di soluzione di arresto in ogni pozzetto e misurare l'OD a 450 nm entro 15 min.

Calcolo dei risultati
Tracciare la curva standard riportando l'OD degli standard in funzione della concentrazione per costruire la curva, ottenere l'equazione di regressione e calcolare la concentrazione dei campioni sostituendo l'OD del campione nell'equazione.

Prestazioni

• Intervallo di rilevamento: 0,5–16 ng/mL
• Sensibilità: < 0,1 ng/mL
• Specificità: Nessuna reattività crociata con analoghi solubili correlati
• Ripetibilità: CV intra‑saggio < 10 %; CV inter‑saggio < 15 %

Note / Considerazioni importanti

• 1. Diluite i campioni che superano la concentrazione massima degli standard prima dell'analisi.
• 2. Rispettare rigorosamente i tempi e le temperature di incubazione; portare i reagenti a 20–25°C prima dell'uso e refrigerarli dopo l'uso.
• 3. Un lavaggio inadeguato o l'essiccazione dei pozzetti può causare risultati inaccurati; garantire un corretto lavaggio ed evitare l'essiccazione durante le incubazioni.
• 4. Rimuovere residui liquidi e impronte digitali dal fondo della piastra per evitare interferenze sull'OD.
• 5. Il substrato deve essere incolore o molto chiaro; non usare se è diventato blu.
• 6. Evitare la contaminazione incrociata di reagenti e campioni.
• 7. Proteggere reagenti e reazioni dall'esposizione a forte luce durante lo stoccaggio e le incubazioni.
• 8. Portare a temperatura ambiente le buste sigillate prima dell'apertura per evitare condensa.
• 9. Evitare il contatto dei reagenti con agenti sbiancanti o vapori di solventi forti.
• 10. Non utilizzare prodotti scaduti.
• 11. Manipolare campioni potenzialmente infettivi secondo le procedure di biosicurezza applicabili.

Specifiche tecniche

• Cod. prodotto: CFTK-HMM-0076
• Specie testata: Umana
• Durata: 6 mesi
• Conservazione: 2–8°C
• Principio di rilevamento: ELISA sandwich in un unico passaggio a doppio anticorpo; rilevamento HRP/TMB; lettura OD a 450 nm
• Punti curva standard: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 ng/mL
• Intervallo di rilevamento: 0,5–16 ng/mL
• Sensibilità: < 0,1 ng/mL
• CV intra‑saggio: < 10 %; CV inter‑saggio: < 15 %