La DNA ligasi T4 catalizza la formazione di un legame fosfodiestere tra il 5'-fosfato e il 3'-idrossile adiacenti sull'estremità smussata o coesiva del dsDNA. Può anche catalizzare il legame tra RNA e ssDNA o RNA negli acidi nucleici a doppio filamento. Tuttavia, non può catalizzare legami tra nucleotidi a singolo filamento. La DNA ligasi T4 può essere utilizzata per l'etichettatura dell'estremità 3'dell'RNA, la ciclizzazione di oligonucleotidi di RNA e DNA, il clonaggio di cDNA e altre manipolazioni di acidi nucleici.
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