Sistema di fotometria in fibra da ricerca FLiP

per neuroscienzacon fibra otticaa fluorescenza

Panoramica
Il RWD Fluorescence Lifetime Photometry System (FLiP) combina Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) con fotometria a fibra per monitorare in tempo reale le variazioni della durata di vita della fluorescenza nel cervello di animali in libertà. FLiP consente misure in vivo stabili e quantitative delle dinamiche dei neurotrasmettitori, delle interazioni proteina–proteina e dei cambiamenti conformazionali, riportando la durata di vita della fluorescenza (τ), un parametro intrinseco in gran parte indipendente dal livello di espressione del sensore, dal fotobleaching e dagli artefatti di movimento.

Perché la durata di vita della fluorescenza?

• La durata di vita è indipendente dalla concentrazione del fluoroforo e dalla potenza di eccitazione e riflette il microambiente locale e i cambi conformazionali.
• Fornisce letture quantitative comparabili tra campioni senza necessità di normalizzazione alla baseline.
• Adatta a registrazioni stabili a lungo termine in studi sul sonno, modelli di malattie croniche e studi longitudinali.
• Consente la rilevazione sensibile di cambiamenti dinamici degli analiti mediante biosensori basati sulla durata di vita.

Due metodi di misura principali

• Dominio temporale (TCSPC): eccita il campione con luce pulsata e registra il decadimento temporale della fluorescenza. TCSPC marca temporalmente i fotoni individuali per costruire istogrammi di decadimento ed estrarre le durate di vita tramite fitting esponenziale. Offre alta risoluzione temporale e SNR superiore a flussi di fotoni bassi; risolve più componenti di durata di vita con alta precisione.
• Dominio di frequenza: eccita con luce continua modulata sinusoidalmente e ricava la durata di vita dal ritardo di fase e dalla profondità di modulazione. Implementazione più semplice e acquisizione rapida, adatta a campioni ad alto flusso di fotoni o sistemi senza laser pulsato.

Confronto (Dominio temporale vs Dominio di frequenza)

• Precisione di misura della durata di vita — Dominio temporale (TCSPC): alta; Dominio di frequenza: buona
• SNR per campioni debolmente fluorescenti — Dominio temporale (TCSPC): eccellente; Dominio di frequenza: relativamente limitato
• Risoluzione di più componenti di durata di vita — Dominio temporale (TCSPC): alta precisione; Dominio di frequenza: richiede modulazione multifrequenza o analisi phasor
• Velocità di acquisizione — Dominio temporale (TCSPC): relativamente veloce; Dominio di frequenza: veloce
• Campioni ad alto flusso di fotoni — Dominio temporale (TCSPC): buono; Dominio di frequenza: eccellente
• Requisito laser — Dominio temporale (TCSPC): laser pulsato; Dominio di frequenza: sorgente continua modulata

Punti salienti del sistema FLiP

• Stabilità del sistema progettata per minimizzare le fluttuazioni dello stato del dispositivo e consentire confronti longitudinali affidabili.
• Basso rumore di sistema per preservare l'integrità del segnale a livelli di fluorescenza deboli.
• Possibilità di registrazioni a lungo termine con deriva di baseline minimizzata su settimane consecutive.
• Compatibilità con un'ampia gamma di biosensori per misura della durata di vita.
• Analisi quantitativa diretta: funzionalità di curva standard prevista per convertire le letture di durata di vita in stime di concentrazione.

Esempi di applicazione

• Misure di neuromodulatori su scale croniche e inter‑animali: le letture di durata di vita (es. GRAB ACh3.0) rimangono stabili nonostante variazioni di potenza laser ed espressione, e possono distinguere stati comportamentali.
• Studi meccanicistici di geni di rischio psichiatrico: FLiP utilizzato per rivelare dinamiche anomale dell'attività PKA nello striato di topi mutanti Akap11 in registrazioni di animali in libertà.
• Sviluppo e validazione di nuovi sensori di durata di vita: es. LifeCamp, sensore di durata di vita del calcio che permette la misura assoluta dei segnali di calcio transitori e basali attraverso tipi cellulari e comportamenti.

Caratteristiche / specifiche tecniche

• Specifiche generali del sistema
  • Opzioni di lunghezze d'onda di eccitazione: 488, 515, 560, 640, 670 nm (personalizzabile)
  • Frequenza di impulso: 1–80 MHz
  • Intervallo di misura della durata di vita: 1–10 ns
  • Frequenza di campionamento: 1–50 Hz
  • Conteggio DIO: 8
  • Livello di tensione: 3.3–5 V
  • Diametro del nucleo della fibra ottica: 200 o 400 µm
  • Apertura numerica (NA): 0.37
• Compatibilità biosensori di durata di vita (esempi con lunghezze d'onda di eccitazione)
  • Ca2+: Tq–Ca–FLITS — eccitazione ~439 nm; tr-CCaMP — ~437 nm; tr-GCaMP — ~493 nm; tr-RCaMP — ~563 nm; RCaMP1h — ~560 nm; LifeCaMP — ~488 nm
  • ACh (acetilcolina): GRAB ACh3.0 — 488 nm; varianti GRAB FLIM-ACh — 515 nm; GRAB WHalo-ACh-1.0 (a base di colorante) — 565 nm / 680 nm (dyes JF)
  • DA (dopamina): dLight3.8 — 488 nm; GRAB FLIM-DA1.0 — 515 nm
  • PKA: tAKARα, tAKARβ, tAKARγ — 488 nm; FLIM-AKAR — 488 nm; GRAB FLIM-PKA — 515 nm
  • PKC: CKAR3 — 488 nm
  • Glutammato extracellulare: Rncp-iGluSnFR1 — 560 nm
  • Serotonina (5-HT): sDarken — 488 nm
  • Noradrenalina (NE): GRAB FLIM-NE1h / GRAB FLIM-NE1m — 515 nm; GRAB rNE3.0 — 560 nm; GRAB TMP-NE1.0 (a base di colorante) — ~690 nm; GRAB WHalo-NE — 565 nm / 680 nm (dyes JF)
  • 5-HT (variante): GRAB FLIM-5-HT0.3 — 515 nm
  • CRF: GRAB rCRF1.0 — 570 nm
  • PACAP: GRAB rPACAP1.0 — 570 nm
  • Glucosio: iGlucoSnFR-TS — 400 nm
  • Lattato: LiLac — 425 nm
  • ATP: qMaLioffG — 488 nm