Sistema di fotometria in fibra da ricerca FLiP

per neuroscienzacon rete neuralecon fibra ottica

Panoramica
Il sistema RWD di fotometria della durata di vita della fluorescenza (FLiP) si basa sulla tecnologia Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) abbinata alla fotometria con fibra per monitorare in tempo reale le variazioni della durata di vita della fluorescenza nel cervello di animali in movimento libero, offrendo un approccio stabile e quantitativo per studi in vivo sulla liberazione di neurotrasmettitori, sulle interazioni proteina–proteina e sui cambi conformazionali delle proteine.

Cos'è la durata di vita della fluorescenza?
La durata di vita della fluorescenza (τ) è il tempo medio in cui un fluoroforo rimane nello stato eccitato prima di emettere un fotone. A differenza dell'intensità di fluorescenza, la durata di vita è indipendente dalla concentrazione del fluoroforo e dalla potenza di eccitazione e riflette cambiamenti conformazionali e il microambiente locale. Le misure di durata di vita permettono di separare più componenti di durata e di rilevare variazioni sottili, fornendo un segnale quantitativo stabile per esperimenti in vivo.

Perché la durata di vita della fluorescenza?

• Misurazioni quantitative e confrontabili fra campioni — senza normalizzazione al baseline
• Registrazioni stabili a lungo termine — adatte a studi sul sonno, modelli di malattie croniche e studi longitudinali
• Rilevamento sensibile dei cambiamenti dinamici degli analiti tramite biosensori basati sulla durata di vita

Due metodi di misura principali
Dominio temporale
Eccita il campione con una sorgente luminosa pulsata e registra il decadimento temporale della fluorescenza. Il TCSPC misura le differenze temporali tra i fotoni emessi e gli impulsi di eccitazione per costruire istogrammi di decadimento e adattamenti esponenziali, offrendo elevata risoluzione temporale, ottimo SNR a basso flusso di fotoni e separazione precisa delle componenti di durata di vita.

Dominio di frequenza
Utilizza una sorgente continua modulata sinusoidalmente e ricava la durata di vita dal ritardo di fase e dalla profondità di modulazione tra emissione ed eccitazione. I sistemi in dominio di frequenza sono più semplici, consentono acquisizioni rapide e possono funzionare senza laser pulsati, risultando adatti a misure ad alto flusso di fotoni.

Confronto (Dominio temporale vs Dominio di frequenza)

• Accuratezza della misura della durata: Dominio temporale — alta; Dominio di frequenza — buona
• SNR per campioni debolmente fluorescenti: Dominio temporale — eccellente; Dominio di frequenza — relativamente limitato
• Risoluzione di più componenti: Dominio temporale — alta precisione; Dominio di frequenza — richiede modulazione multifrequenza o analisi phasor
• Velocità di acquisizione: Dominio temporale — relativamente veloce; Dominio di frequenza — veloce
• Campioni ad alto flusso di fotoni: Dominio temporale — buono; Dominio di frequenza — eccellente
• Requisito laser: Dominio temporale — laser pulsato; Dominio di frequenza — sorgente continua modulata

Punti di forza del sistema di fotometria della durata di vita

• Stabilità del sistema eccezionale: prestazioni costanti che minimizzano le fluttuazioni dello stato del dispositivo per confronti longitudinali affidabili
• Rumore di sistema ultra-basso: preserva l'integrità dei dati anche in condizioni di segnale debole
• Registrazione affidabile a lungo termine: componenti centrali stabili che riducono la deriva del baseline su settimane consecutive
• Ampia compatibilità con biosensori: supporta l'intervallo di progettazione della durata di vita dei biosensori principali
• Analisi quantitativa diretta: funzione di curva standard prevista per abilitare letture dirette di concentrazione

Esempi di applicazione

• Misurazioni di neuromodulatori tra animali e su scale temporali croniche: FLiP consente confronti basati sulla durata di vita tra animali e su settimane per sensori come GRAB ACh3.0
• Studi meccanicistici in modelli genetici: utilizzato per rivelare dinamiche anomale dell'attività PKA in topi mutanti Akap11 e le risposte farmacologiche correlate
• Validazione di nuovi sensori: validazione del sensore di calcio a durata di vita ad alta velocità (LifeCamp) per misure di baseline assoluta e transitorie del calcio in topi in libertà

Specifiche tecniche

• Lunghezze d'onda di eccitazione: 488, 515, 560, 640, 670 nm (personalizzabile)
• Frequenza di impulso: 1–80 MHz
• Intervallo di misura della durata di vita: 1–10 ns
• Frequenza di campionamento: 1–50 Hz
• Conteggio DIO: 8
• Livello di tensione: 3,3–5 V
• Diametro del nucleo della fibra ottica: 200 o 400 µm
• Apertura numerica (NA): 0,37